Synergistic action of actinoporin isoforms from the same sea anemone species assembled into functionally active heteropores

Among the toxic polypeptides secreted in the venom of sea anemones, actinoporins are pore forming toxins whose toxic activity relies on the formation of oligomeric pores within biological membranes. Intriguingly, actinoporins appear as multigene families which give rise to many protein isoforms in the same individual displaying high sequence identities but large functional differences. However, the evolutionary advantage of producing such similar isotoxins is not fully understood. Here, using sticholysins I and II (StnI and StnII) from the sea anemone Stichodactyla helianthus, it is shown that actinoporin isoforms can potentiate each other’s activity. Through hemolysis and calcein releasing assays, it is revealed that mixtures of StnI and StnII are more lytic than equivalent preparations of the corresponding isolated isoforms. It is then proposed that this synergy is due to the assembly of heteropores since (i) StnI and StnII can be chemically cross-linked at the membrane and (ii) the affinity of sticholysin mixtures for the membrane is increased with respect to any of them acting in isolation, as revealed by isothermal titration calorimetry experiments. These results help to understand the multigene nature of actinoporins and may be extended to other families of toxins that require oligomerization to exert toxicity.

Toxin-induced pore formation is hindered by intermolecular hydrogen bonding in sphingomyelin bilayers

Sticholysin I and II (StnI and StnII) are pore-forming toxins that use sphingomyelin (SM) for membrane binding. We examined how hydrogen bonding among membrane SMs affected the StnI- and StnII-induced pore formation process, resulting in bilayer permeabilization. We compared toxin-induced permeabilization in bilayers containing either SM or dihydro-SM (lacking the trans 4 double bond of the long-chain base), since their hydrogen-bonding properties are known to differ greatly. We observed that whereas both StnI and StnII formed pores in unilamellar vesicles containing palmitoyl-SM or oleoyl-SM, the toxins failed to similarly form pores in vesicles prepared from dihydro-PSM or dihydro-OSM. In supported bilayers containing OSM, StnII bound efficiently, as determined by surface plasmon resonance. However, StnII binding to supported bilayers prepared from dihydro-OSM was very low under similar experimental conditions. The association of the positively charged StnII (at pH 7.0) with unilamellar vesicles prepared from OSM led to a concentration-dependent increase in vesicle charge, as determined from zeta-potential measurements. With dihydro-OSM vesicles, a similar response was not observed. Benzyl alcohol, which is a small hydrogen-bonding compound with affinity to lipid bilayer interfaces, strongly facilitated StnII-induced pore formation in dihydro-OSM bilayers, suggesting that hydrogen bonding in the interfacial region originally prevented StnII from membrane binding and pore formation. We conclude that interfacial hydrogen bonding was able to affect the membrane association of StnI- and StnII, and hence their pore forming capacity. Our results suggest that other types of protein interactions in bilayers may also be affected by hydrogen-bonding origination from SMs.

Dopamine signaling is essential in cognitive process and motor performance

La dopamina es uno de los principales neurotransmisores del sistema nervioso central y desempeña un papel esencial en diferentes funciones: neuroendocrinas, motivacionales/emocionales y, especialmente, motoras y cognitivas. Las funciones de la dopamina están media-das en gran medida por la estimulación de sus principales receptores D1 (D1R) y D2 (D2R). En esta tesis hemos estudiado el papel que ambos receptores desempeñan en los procesos de apren-dizaje y memoria, así como la regulación que ejercen sobre las neuronas estriatales TH-immunoreactivas (TH-ir) y su posible implicación en la respuesta motora. Para abordar este proyecto hemos utilizado ratones knock-out para el receptor D1 (Drd1a-/-) y D2 (Drd2-/-) ya que no existen compuestos farmacológicos capaces de diferenciar eficazmente entre receptores dopaminérgicos de la misma familia. Además, para el estudio de las neuronas TH-ir realizamos lesiones con 6-OHDA a ratones que posteriormente recibieron un tratamiento crónico con L-DOPA, siendo este el mecanismo más eficaz para inducir la expresión de las neuronas TH-ir objeto de nuestro estudio. Para completar todo ello realizamos test conductuales que evalúan respuesta motora, como el test del cilindro, y diferentes tipos de aprendizaje y me-moria para los cuales utilizamos test específicos. Entre estos test se encuentran: los laberintos de Barnes y Morris para memoria espacial, evitación activa/pasiva y condicionamiento del mie-do para el aprendizaje asociativo, y el reconocimiento de objetos para la memoria de reconoci-miento...

Aplicación de métodos de aprendizaje automático para el estudio de la comorbilidad inversa entre cáncer y trastornos del sistema nervioso central

La cantidad de datos biológicos y médicos que se produce hoy en día es enorme, y se podría decir que el campo de las ciencias de la vida forma parte ya del club del Big Data. Estos datos contienen información crucial que pueden ayudar a comprender mejor los mecanismos moleculares en los sistemas biológicos. Este conocimiento es fundamental para el progreso en el diagnóstico y en el tratamiento de las enfermedades. La Bioinformática, junto con la Biología Computacional, son disciplinas que se encargan de organizar, analizar e interpretar los datos procedentes de la Biología Molecular. De hecho, la complejidad y la heterogeneidad de los problemas biológicos requieren de un continuo diseño, implementación y aplicación de nuevos métodos y algoritmos. La minería de datos biológicos es una tarea complicada debido a la naturaleza heterogénea y compleja de dichos datos, siendo éstos muy dependientes de detalles específicos experimentales. Esta tesis se basa en el estudio de un problema biomédico complejo: la menor probabilidad de desarrollar algunos tipos de cáncer en pacientes con ciertos trastornos del sistema nervioso central (SNC) u otros trastornos neurológicos, y viceversa. Denominamos a esta condición como comorbilidad inversa. Desde el punto de vista médico, entender mejor las conexiones e interacciones entre cáncer y trastornos neurológicos podría mejorar la calidad de vida y el efecto de la asistencia médica de millones de personas en todo el mundo. Aunque la comorbilidad inversa ha sido estudiada a nivel médico, a través de estudios epidemiológicos, no se ha investigado en profundidad a nivel molecular...

Papel biológico del diadenosin tetrafosfato en el ojo: efecto sobre la composición lacrimal e implicación en la función de barrera corneal

El Ap4A es una molécula con un amplio papel biológico en el ojo. Se ha descrito su implicación en procesos de secreción lagrimal, cicatrización epitelial, regulación de la presión intraocular, y presenta también un papel neuroprotector sobre los terminales simpáticos que inervan el cuerpo ciliar. El objetivo de este trabajo ha sido analizar la participación del Ap4A en otras posibles funciones a nivel ocular. En concreto se ha estudiado la capacidad de este dinucléotido para estimular la liberación de proteínas lagrimales de acción antibacteriana tales como la lisozima y la lactoferrina. Por otra parte se ha investigado su efecto como modulador de la función de barrera de la córnea a través de la regulación de los niveles de expresión de proteínas constituyentes de las tight junctions (TJ). Dicho efecto sobre la barrera puede tener una importante repercusión en la entrada de fármacos y en la consiguiente eficacia terapéutica de los mismos. Por último, se ha estudiado la posible implicación del dinucleótido en el proceso de edematización descrito en modelos animales glaucomatosos tales como el ratón DBA/2J. Con el objetivo de averiguar si la activación de Ap4A inducía un efecto sobre la producción de dos proteínas antimicrobianas relevantes de la lágrima (lisozima y lactoferrina) se realizaron ensayos en la lágrima de conejos albinos de Nueva Zelanda, mediante las técnicas de agar-agar y ELISA. Los resultados obtenidos demostraron que Ap4A produce un aumento en la concentración de lisozima y de lactoferrina del 93% y 24%, respectivamente, frente a valores basales, y este efecto está mediado por receptores de tipo P2...

Obtención de péptidos alimentarios mediante hidrólisis enzimática con efectos sobre la salud intestinal

En la presente Tesis Doctoral, se estudió la obtención e identificación de péptidos alimentarios mediante el uso de hidrólisis enzimática y sus efectos sobre la salud gastrointestinal. La secuenciación y cuantificación de los péptidos se realizó mediante cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (RP-HPLC-MS/MS). Se analizaron distintos hidrolizados y digeridos gastrointestinales de caseínas, proteínas de suero de leche y lunasina. Inicialmente, se propone la producción de caseinofosfopéptidos (CPPs) mediante la hidrólisis con tripsina de un subproducto de caseína generado durante la fabricación de un ingrediente funcional con actividad antihipertensiva. La identificación y la semi-cuantificación de CPPs revelaron algunos cambios cualitativos y cuantitativos en los CPPs generados en los hidrolizados con distintas condiciones de tiempo de hidrólisis y precipitación selectiva. Una vez realizada la identificación de CPPs en los hidrolizados trípticos, el subproducto también se sometió a un proceso de digestión gastrointestinal simulando las condiciones fisiológicas. La comparación de los péptidos resultantes mostró gran homología en las secuencias de CPPs formados por la hidrólisis con tripsina y la digestión gastrointestinal simulada. Se observó que algunas regiones de αS1-caseína, concretamente las comprendidas entre los residuos (43-59) y (60-74), de la αs1-caseína y los residuos (1-25) y (30-50) de β-caseína, fueron capaces de resistir tanto a la hidrólisis con tripsina como a la digestión gastrointestinal. Por lo tanto, se demuestra que el subproducto industrial puede ser empleado como fuente de CPPs para favorecer la absorción de minerales a nivel intestinal...

Corneal Re-epithelialization Stimulated by Diadenosine Polyphosphates Recruits RhoA/ROCK and ERK1/2 Pathways

Purpose. To investigate the role of ERK1/2 and RhoA/ROCK intracellular pathways in the modification of corneal re-epithelialization when stimulated by the diadenosine polyphosphates Ap4A and Ap3A. Methods. In wounded confluent SIRC (Statens Seruminstitut rabbit cornea) cell monolayers and in the presence or absence of Ap4A or Ap3A 100 μM, a battery of P2 receptor antagonists and inhibitors of tyrosin kinases, MAPK, and cytoskeleton pathways (AG1478 100 μM, U0126 100 μM, Y27632 100 nM, and (−)-blebbistatin 10 μM; n = 8 each) were assayed. Also, the activation of ERK1/2 and ROCK-I was examined by Western blot assay after treatment with Ap4A and Ap3A (100 μM), with or without suramin, RB-2, U0126, and Y27632. The intracellular distribution of pERK and ROCK-I was examined in the presence of Ap4A or Ap3A (100 μM) with U0126 and Y27632 (100 nM). Results. In the presence of Ap4A, U0126, Y27632, AG1478, and (−)-blebbistatin, reduced the migration rate compared to the effect of Ap4A alone (P < 0.0001, P < 0.001, P < 0.01, and P < 0.1 versus Ap4A, respectively). In the presence of Ap3A 100 μM, U0126 and Y27632 accelerated the migration rate when compared with the effect of Ap3A alone, whereas AG1478 and (−)-blebbistatin (P < 0.0001 versus Ap3A) slowed the migration rate. Western blot assays demonstrated that both dinucleotides activated the ERK1/2 pathway but only Ap4A activated the ROCK-I pathway. The intracellular distribution of pERK1/2 and ROCK-I reflected cross-talk between these two pathways. Conclusions. The activation of the Ap4A/P2Y2 receptor, accelerates corneal epithelial cell migration during wound healing with the activation of MAPK and cytoskeleton pathways, whereas activation of the Ap3A/P2Y6 receptor signals only the MAPK pathway.

Papel de C3G y p38α en la regulación de la migración, invasión tumoral en carcinoma de colon. Función de fibulina 3

Colorectal cancer (CRC) represents the third most common cancer type and the second leading cause of cancer-related death in the western world. CRC results from the accumulation of both acquired genetic and epigenetic changes that transform normal glandular epithelium into adenocarcinoma (Lao and Grady 2011), affecting several genes such as Apc, K-ras, dcc/Smad4 and p53 or DNA mismatch repair genes (Pancione et al. 2012). p38 MAPKs are a subfamily of Serine-Threonine kinases activated by different stimuli that control fundamental cellular processes such as cell growth, proliferation, differentiation, migration and apoptosis (Dhillon et al. 2007, Nebreda and Porras 2000, Wagner and Nebreda 2009). There are four p38 MAPKs isoforms in mammals: α, β, δ and γ. p38α MAPK is ubiquitously expressed and is the most abundant isoform (Cuenda and Rousseau 2007). p38α is involved in the regulation of many cellular functions, among them, cell migration and invasion. In cancer, it can act as either a promoter or a suppressor of tumor growth, playing different roles during tumor progression (del Barco Barrantes and Nebreda 2012). C3G is a guanine nucleotide exchange factor (GEF) mainly for the Ras family members: Rap1 (Gotoh et al. 1995) and R-Ras (Gotoh et al. 1997), but it can also act through GEF independent mechanisms. C3G regulates several cellular functions such as cell death, adhesion, migration and invasion (Radha et al. 2011). In collaboration with Dr. Carmen Guerrero’s group (Centro del Investigación del Cáncer de Salamanca), our group has found a new functional relationship between C3G and p38α MAPK involved in the regulation of cell death in MEFs (Gutierrez-Uzquiza et al. 2010) and in the chronic myeloid leukemia (CML) K562 cell line (Maia et al. 2009). Moreover, C3G and p38α act through a common regulatory pathway to control cell adhesion in K562 cells regulating focal adhesion proteins (Maia et al. 2013)...

Characterization of a new toxin from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae: the ribotoxin anisoplin

Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus relevant in biotechnology with applications like malaria vector control. Studies of its virulence factors are therefore of great interest. Fungal ribotoxins are toxic ribonucleases with extraordinary efficiency against target ribosomes and suggested as potential insecticides. Here, we describe this ribotoxin characteristic activity in M. anisopliae cultures. Anisoplin has been obtained as a recombinant protein and further characterized. It is structurally similar to hirsutellin A, the ribotoxin from the entomopathogen Hirsutella thompsonii. Moreover, anisoplin shows the ribonucleolytic activity typical of ribotoxins and cytotoxicity against insect cells. How Metarhizium uses this toxin and possible applications are on perspective.